Khẩu độ NA là gì trong kính hiển vi?

Khẩu độ NA (Numerical Aperture) là một trong những thông số quan trọng nhất trên kính hiển vi quang học. Đây là thông số quyết định khả năng thu nhận ánh sáng và tái tạo chi tiết hình ảnh của vật kính cũng như tụ quang.

Trong thực tế, nhiều người chỉ quan tâm đến độ phóng đại 40x, 100x hay 1000x. Tuy nhiên, độ sắc nét hình ảnh lại phụ thuộc rất lớn vào khẩu độ số NA. Một kính hiển vi có độ phóng đại cao nhưng NA thấp vẫn cho hình ảnh mờ, thiếu chi tiết và khó lấy nét.

Công thức của khẩu độ số:

NA = n × sin(α)

Trong đó:

n là chiết suất môi trường giữa vật kính và mẫu vật
α là góc thu nhận ánh sáng của vật kính

Vì NA của không khí ~1 (n=1) do đó góc α càng lớn thì NA càng cao, NA cao thì vật kính càng thu được nhiều ánh sáng và chi tiết hơn. NA lý thuyết đối với vật kính khô không dùng chất lỏng ngâm sẽ bằng sin 90 độ bằng 1(gần như không thể vì vật kính không thể đặt quá sát mẫu vật ), vật NA cao nhất đối với vật kính khô là bằng 1, thực tế chỉ khoảng 0.95

Do đó vật kính 100x khô NA tối đa chỉ khoảng 0.9 thấp hơn nhiều so với 100x ngâm dầu NA đạt 1.25 tới 1.4, cho hình ảnh nét hơn.

Vì sao khẩu độ NA quan trọng hơn độ phóng đại?

Độ phóng đại không quyết định độ nét

Một sai lầm phổ biến khi chọn kính hiển vi là nghĩ rằng:

Phóng đại càng cao thì hình càng rõ.

Thực tế không hoàn toàn như vậy.

Nếu vật kính có độ phóng đại lớn nhưng khẩu độ NA thấp thì hình ảnh chỉ được phóng to lên nhưng không tăng thêm chi tiết. Điều này gọi là:

Phóng đại rỗng (Empty magnification)
Điều này chỉ làm cho ảnh trông to hơn nhưng không sắc nét hơn

Ví dụ:

Vật kính	Độ phóng đại	NA
10x	0.25	Hình cơ bản
40x	0.65	Nhiều chi tiết hơn
100x Oil	1.25	Độ phân giải cao

Một vật kính 40x NA 0.75 thường cho hình sắc nét hơn nhiều so với vật kính 40x NA 0.65, Cùng độ phóng đại vật kính nào có NA cao hơn thì cho hình ảnh sắc nét hơn, và giá thành cũng cao hơn, các vật kính 40x tương tự nếu thiết kế để ngâm dầu có thể đạt NA lên tới 1.3, cho hình ảnh siêu sắc nét

Khẩu độ NA ảnh hưởng thế nào tới độ sắc nét hình ảnh?

1. Ảnh hưởng tới độ phân giải

Độ phân giải là khả năng phân biệt hai điểm rất gần nhau.

Theo công thức quang học:

D = 0.61λ / NA

Trong đó:

D là độ phân giải
λ là bước sóng ánh sáng
NA là khẩu độ số

NA càng cao thì D càng nhỏ, nghĩa là khả năng nhìn thấy chi tiết càng tốt.

Ví dụ:

Vật kính NA 0.25 chỉ thấy chi tiết cơ bản
Vật kính NA 0.95 thấy rõ cấu trúc tế bào
Vật kính dầu NA 1.4 có thể quan sát vi khuẩn rất nhỏ

Đây là lý do kính hiển vi nghiên cứu luôn ưu tiên vật kính NA cao.

2. Ảnh hưởng tới độ sáng hình ảnh

NA càng lớn thì lượng ánh sáng đi vào vật kính càng nhiều.

Kết quả:

Hình sáng hơn
Tăng độ tương phản
Camera thu hình tốt hơn
Ít nhiễu hơn

Ngược lại, NA thấp khiến:

Hình tối
Khó quan sát
Hình bị bệt
Giảm chi tiết

Đặc biệt khi dùng camera kính hiển vi, NA thấp sẽ làm ảnh bị noise rất mạnh.

3. Ảnh hưởng tới độ sâu trường ảnh

Khẩu độ NA cao giúp tăng độ nét nhưng lại làm giảm độ sâu trường ảnh.

Điều này có nghĩa:

Chỉ một lớp mỏng của mẫu vật được nét
Khó lấy nét hơn
Dễ bị lệch focus

Ví dụ:

NA	Đặc điểm
Thấp	Dễ lấy nét, vùng nét dày
Cao	Hình cực sắc nét nhưng vùng nét mỏng

Do đó kính hiển vi sinh học thường cần chỉnh focus rất chính xác.

Khẩu độ NA của vật kính và tụ quang khác nhau thế nào?

NA của vật kính

Đây là thông số quan trọng nhất.

Nó quyết định:

Độ phân giải
Độ sắc nét
Khả năng thu sáng

Thông thường thông số NA được in trên vật kính:

Ví dụ:

40x/0.65
100x/1.25 Oil

Trong đó:

40x là độ phóng đại
0.65 hoặc 1.25 là khẩu độ số NA

NA của tụ quang

Tụ quang condenser cũng có NA riêng.

Nhiệm vụ:

Hội tụ ánh sáng vào mẫu
Điều chỉnh góc chiếu sáng
Hỗ trợ độ phân giải

Nếu tụ quang chỉnh sai NA:

Hình bị mờ
Mất tương phản
Giảm chi tiết

Cách đọc thông số khẩu độ NA trên vật kính

Ví dụ thực tế

10x/0.25

Phóng đại 10 lần
NA = 0.25
Dùng quan sát tổng quát

40x/0.65

Phóng đại 40 lần, NA 0.65
Độ phân giải cao hơn
Quan sát tế bào tốt

100x/1.25 Oil

Dùng dầu soi
Độ sắc nét rất cao
Quan sát vi khuẩn

Vì sao vật kính dầu có NA lớn hơn 1?

Trong không khí:

Chiết suất n ≈ 1

Do đó NA khó vượt quá 1.

Khi dùng dầu soi:

dầu soi kính hiển vi — Dầu soi kính hiển vi

Chiết suất dầu ≈ 1.515

NA có thể đạt:

1.25
1.3
1.4

Điều này giúp:

Thu nhiều ánh sáng hơn
Giảm tán xạ
Tăng độ phân giải

Đây là lý do vật kính 100x Oil luôn sắc nét hơn vật kính khô.

Cách chỉnh khẩu độ tụ quang trên kính hiển vi quang học

Tụ quang là gì?

Tụ quang condenser nằm dưới bàn di mẫu

Nhiệm vụ:

Tập trung ánh sáng
Điều khiển góc chiếu
Tối ưu độ tương phản

Bên trong tụ quang có:

Iris diaphragm
Khẩu độ condenser

Đây chính là nơi điều chỉnh NA của hệ thống chiếu sáng.

Nguyên tắc chỉnh khẩu độ tụ quang đúng

Quy tắc quan trọng

NA của tụ quang nên bằng khoảng:

80% hoặc bằng NA của vật kính

Nếu mở quá lớn:

Hình sáng
Nhưng giảm tương phản

Nếu đóng quá nhỏ:

Hình tối
Hình nét giả
Mất chi tiết nhỏ

Hướng dẫn chỉnh khẩu độ tụ quang từng bước

Bước 1: Đặt tiêu bản và lấy nét

Đặt mẫu vật lên bàn kính
Chọn vật kính mong muốn
Lấy nét rõ trước

Bước 2: Mở sáng vừa đủ

Điều chỉnh:

Đèn LED hoặc halogen
Brightness

Không nên tăng sáng quá mạnh.

Bước 3: Điều chỉnh iris diaphragm

Quan sát qua thị kính:

Đóng khẩu độ từ từ
Hình sẽ tăng tương phản
Sau đó mở nhẹ trở lại

Điểm tối ưu là:

Hình vừa nét
Vừa đủ sáng
Chi tiết rõ nhất

Bước 4: Kiểm tra độ sắc nét

Quan sát các chi tiết nhỏ:

Viền tế bào
Nhân tế bào
Cấu trúc mô

Nếu hình:

Mờ → mở khẩu độ thêm
Cháy sáng → giảm khẩu độ

Cách chỉnh tụ quang theo từng vật kính

Với vật kính 4x và 10x

Nên:

Đóng khẩu độ nhiều hơn
Tăng tương phản

Do những vật kính này có NA thấp.

Với vật kính 40x

Nên:

Mở khẩu độ lớn hơn so với 4x và 10x
Tăng lượng sáng

Để đạt độ phân giải cao.

Với vật kính 100x Oil

Phải:

Mở gần tối đa
Tụ quang nâng sát bàn mẫu

Nếu không:

Hình cực mờ
Không đủ độ phân giải

Dấu hiệu chỉnh khẩu độ tụ quang sai

Mở khẩu độ quá lớn

Biểu hiện:

Hình trắng bệt
Thiếu tương phản
Khó thấy ranh giới tế bào

Đóng khẩu độ quá nhỏ

Biểu hiện:

Hình tối
Có vẻ nét giả
Mất chi tiết nhỏ

Mối liên hệ giữa NA và kỹ thuật chiếu sáng Köhler

Köhler illumination là kỹ thuật chiếu sáng chuẩn trong kính hiển vi.

Kỹ thuật này giúp:

Ánh sáng đều
Tăng độ phân giải
Tối ưu NA của tụ quang

Nếu chỉnh Köhler đúng:

Hình sắc nét hơn nhiều
Camera hoạt động hiệu quả hơn
Giảm hiện tượng flare

Cách chọn vật kính theo khẩu độ NA

Quan sát cơ bản

Chọn:

NA thấp tới trung bình
0.1 – 0.4

Ưu điểm:

Dễ dùng
Giá rẻ
Depth of field lớn

Nghiên cứu sinh học, Giải phẫu bệnh

Nên chọn:

NA từ 0.65 trở lên

Giúp:

Quan sát tế bào rõ
Độ phân giải cao

Vi khuẩn học, vi sinh

Nên dùng:

100x Oil
NA 1.25 trở lên

Để:

Quan sát vi khuẩn
Nhìn cấu trúc nhân tế bào
Đánh giá mô học chính xác

Những hiểu lầm phổ biến về khẩu độ NA

Hiểu lầm 1: Zoom lớn là nét hơn

Sai.

NA mới là yếu tố quyết định độ phân giải.

Hiểu lầm 2: Mở tụ quang tối đa luôn tốt

Sai.

Mở quá lớn làm giảm tương phản.

Hiểu lầm 3: Vật kính nào cũng chỉnh tụ quang giống nhau

Sai.

Mỗi vật kính cần khẩu độ khác nhau.

Mẹo tăng độ nét khi dùng kính hiển vi quang học

Luôn vệ sinh vật kính

Bụi và dầu bẩn làm giảm hiệu quả NA.

Dùng cover glass (lamen) đúng chuẩn

Lam kính quá dày gây sai lệch quang học. độ dày lamen ghi trên vật kính bao nhiêu thì lamen càng đúng với thông số đó hình ảnh càng sắc nét

Dùng dầu soi đúng loại

Sai dầu soi sẽ:

Giảm NA thực tế
Giảm độ nét, dầu soi quá hạn, hoặc dùng dầu có NA thấp ảnh hưởng tới chất lượng hình ảnh, nên dùng dầu soi chính hãng

Chỉnh tụ quang đúng

Đây là bước nhiều người bỏ qua nhất nhưng ảnh hưởng cực lớn tới hình ảnh.

Kết luận

Khẩu độ NA là yếu tố quan trọng nhất quyết định độ sắc nét của kính hiển vi quang học. Một hệ thống có NA cao sẽ cho:

Độ phân giải tốt hơn
Hình ảnh sáng hơn
Quan sát chi tiết rõ hơn

Bên cạnh vật kính, việc chỉnh đúng khẩu độ tụ quang cũng cực kỳ quan trọng. Khi tụ quang được điều chỉnh phù hợp với NA của vật kính, hình ảnh sẽ đạt độ nét và tương phản tối ưu.

Nếu muốn hình ảnh kính hiển vi sắc nét chuyên nghiệp, đừng chỉ nhìn vào độ phóng đại. Hãy chú ý tới thông số Numerical Aperture (NA) và kỹ thuật chỉnh tụ quang đúng cách.